Искусственный фотосинтез 

Среди возобновляемых источников энергии солнечная энергия все еще используется в недостаточной мере. Водород - один из наиболее перспективных видов топлива будущего. Как один из основных компонентов в структуре молекулы воды водород - это широко распространенный, имеющийся на нашей планете в избытке, возобновляемый источник энергии, не дающий при сгорании никаких загрязнений окружающей среды, выделяющий при сжигании большое количество энергии на единицу веса и который может быть легко преобразован в электричество с помощью топливных ячеек. Уникальность фотосистемы 2 (ФС-2) заключается в том, что это единственный существующий в природе ферментный комплекс способный использовать энергию солнечного света для окисления воды до кислорода (О₂), ионов водорода (протонов, H⁺) и электронов. Для производства водорода с помощью искусственного фотосинтеза необходимы восстанавливающие эквиваленты и протоны. Вода единственный существующий в природе в неограниченных объемах возобновляемый источник электронов, уникальность которого заключается в том, что вода служит также неисчерпаемым, возобновляемым источником протонов. Если бы удалось достигнуть сопряжения реакции фотосинтетического окисления воды с реакцией восстановления протонов до водорода (H₂), то, таким образом, удалось бы создать цикл производства уникального, совершенного, неограниченного в объемах производства, и незагрязняющего окружающую среду топлива.

В процессе решения задач, сформулированных в планах лаборатории, будут получены новые знания о механизме фотосинтетического окисления воды, о путях и интермедиатах, участвующих в доставке молекул воды к реакционному центру водоокисляющего комплекса (ВОК) ФС-2 и отводе освобождающихся ионов водорода (протонов), о возможностях замещения природного ВОК искусственными металлсодержащими органическими комплексами и критериях, предъявляемых к ним, о способах оптимизации функционирования ВОК, повышения скорости его функционирования, эффективности и стабильности. Кроме того, будут также получены новые данные о нерешенных вопросах функционирования акцепторной стороны ФС-2, о возможностях замещения нативных акцепторов электрона, пластохинона Q_A и феофитина искусственными акцепторами электрона с заданными свойствами, а также соединениями, ферментами и/или их комплексами, способными осуществлять реакцию восстановления протонов до водорода за счет электронов и протонов, получаемых в реакции окисления воды.

Конкретной задачей лаборатории является поиск путей и получение экспериментальной научной информации о возможностях создания новых высокоэффективных нанобиомолекулярных устройств для превращения солнечной энергии в энергию химических соединений (фотопроизводство водорода), мимикрирующих природный фотосинтез, получение знаний необходимых для разработки, проектирования и построения полу-искусственных и/или искусственных устройств, которые будут способны производить водород. Энергия для этого процесса будет поставляться солнцем, а электроны и протоны – в результате фотосинтетического расщепления воды в оксигенном фотосинтезе. Оба эти процесса бесплатны, а процесс расщепления воды оптимизирован природой уже в течение миллионов лет. Стратегия заключается в том, чтобы использовать те природные компоненты, которые наиболее пригодны для данного устройства, которое будет смесью искусственных и природных компонентов, т.е. самые стабильные фотосистемы – в качестве сенсоров и конверторов света, а гидрогеназы – в качестве производителя водорода. Предполагается получить информацию том, как создать такие полусинтетические устройства, основанные (на первом этапе) на коровых комплексах или комплексах реакционных центров ФС-2 и природных (на первом этапе) или полностью искусственных синтетических гидрогеназах.

Будут получены экспериментальные данные о новых методах утилизации солнечной энергии, которые в наименьшей возможной степени будут зависеть от необходимости использовать редкие элементы и/или тяжелые металлы. В будущем даже возможно будет перейти к разработке искусственно оптимизированных структур фиксации двуокиси углерода на основе биоорганических ресурсов. Кроме того, с помощью такого подхода, возможно, удастся подойти к решению экологических проблем все возрастающего перенасыщения атмосферы Земли “парниковым” газом и глобального потепления.

Лаборатория имеет многолетний богатый успешный опыт исследований в данной области знаний. Нами были показано что феофитин «а» (Pheo) функционирует в реакционных центрах фотосистемы 2 (ФС-2) в качестве промежуточного акцептора электрона между первичным донором, хлорофиллом P₆₈₀ и первичным акцептором электрона, пластохиноном Q_A. Величины окислительно-восстановительного потенциала Pheo составляет -536 мВ, P680 - +1,18 В. Впервые получены экспериментальные доказательства рекомбинационного происхождения «переменной» флуоресценции хлорофилла ФС-2, определены ее время жизни (2-4 нсек) и энергия активации 0,6-0,8 эВ). Продемонстрирована способность ФС-2 к фотовосстановлению акцепторов электронов, типичных для ФС-1 - метилвиологена и НАДФ⁺. Показана возможность использования реакции фотовосстановления Pheo для количественной оценки содержания ФС-2 в целых клетках, хлоропластах и субхлоропластных препаратах [см. Аллахвердиев, Климов, Клеваник, Шувалов, Красновский, 1977-1986].

Показано, что после полного (более, чем 95%) удаления эндогенного Mn из водоокисляющего комплекса (ВОК) ФС-2 транспорт электронов через ФС-2 [Klimov et al., 1982, Аллахвердиев с соавт., 1983; 1986; Allakhverdiev et al., 1986; Шафиев с соавт., 1988;Allakhverdiev & Klimov 1992], а также функция фотосинтетического выделения кислорода [Шафиев с соавт., 1988; Ананьев с соавт., 1988] могут быть восстановлены путем добавления четырех ионов Mn²⁺ на один РЦ и последующей фотоактивации системы. Эти функции ФС-2 могут быть восстановлены только в присутствии бикарбоната [Allakhverdiev et al., 1997]. Два из ионов Mn²⁺ могут быть заменены ионами Mg²⁺ или ионами других двухвалентных металлов.

Перенос электрона через ФС-2, истощенную по эндогенному Mn, а также в изолированных комплексах D1/D2/цитохром b559 реакционных центров ФС-2 может быть реконструирован с помощью синтетических двух и трех ядерных Mn-органических комплексов на основе триподных лигандов [Allakhverdiev et al., 1994; Nagata et al., 2008; Kurashov etal., 2009]. Реконструированная ФС-2, с высокой эффективностью окисляет воду с образованием пероксида водорода. Это первое сообщение о разработке неприродного фотохимического окисления воды осуществляемого реконструированной ФС-2 [Nagata etal., 2008].

Выявлены уникальные, высокоэффективные и высокоспецифичные ингибиторы переноса электрона в ФС-2 типа К-15, производные перфторизопропилдинитробензола (около 30 соединений), исследован механизм их действия, проведен анализ зависимости механизма и эффективности ингибирующего действия от молекулярной структуры (SQAR-анализ) [Karacanet al., 2012] и показано, что механизм их действия принципиально отличается от такого для известных ингибиторов и заключается в образование короткого цикла переноса электрона от восстановленного первичного акцептора электрона феофитина на окисленный первичный донор, хлорофилл P680 [Klimov etal., 1995]. Показано, что участком связывания новых ингибиторов типа К15 (производных перфторизопропилдинитробензола) служит полипептид Д2, интегральный компонент реакционного центра ФС-2, а не известный хинон-гербицид-связывающий участок, расположенный на Д1 белке [Жармухамедов с соавт., 2003]. Уникальность этих соединений заключается в способности перехватывать электрон с восстановленного феофитина эффективно конкурируя с нативным переносом электрона. Эти агенты могут быть использованы для создания искусственных фотопреобразующих систем.

Показано, что полипептиды КВК ФС-2 обладают карбоангидразной активностью, подавление которой сопровождается ингибированием функциональной активности ФС-2 и как следствие этого процесса фотосинтеза в целом [Shitov et al., 2011]. Для регуляции карбоангидразной и, как следствие, функциональной активности ФС-2 разработаны, синтезированы и исследованы по их подавляющему действию на карбоангидразную активность a-карбоангидразы изофермента II из эритроцитов быка, b-карбоангидразы, а также на карбоангидразную и фотосинтетическую активность субхлоропластных мембранных фрагментов, обогащенных ФС-2, BBY-частиц новые химические соединения производные сульфамида и их комплексы с атомами меди (CuII), никеля (Ni), хрома (Cr), кобальта (Co) и цинка (Zn) (30 соединений). Среди этих соединений выявлены высокоэффективные ингибиторы карбоангидразной активности традиционных карбоангидраз и, что особенно важно, карбоангидразной и, как следствие этого, функциональной активности ФС-2 [Karacan etal., 2014]. Эти соединения могут быть использованы для изучения возможностей оптимизации функциональной активности полусинтетических фотопреобразующих систем.

C помощью техники газовой хроматографии измерены скорости выделения водорода при освещении разных субхлоропластных препаратов из высших растений в отсутствии экзогенной гидрогеназы в анаэробных условиях. Показано, что субхлоропластные препараты, обогащенные ФС-2 в присутствии донора электрона TMPD (N,N,N,N-тетра метил-п-фенилендиамина) показывают более высокие скорости выделения водорода (вплоть до 30 наномоль на мг хлорофилла в час), чем препараты, обогащенные ФС-1 в тех же самых условиях. Данные по подавлению выделения водорода известными ингибиторами ФС-2 (диносебом и атразином) доказывают, что фотопроизводство водорода сенсибилизируется реакционными центрами ФС-2 [Mal’tsevet al., 1988].

У коллектива имеется большой успешный опыт по изысканию возможных путей разработки, конструирования и создания полуискусственных и искусственных фотопреобразующих систем, мимикрирующих фотосинтез. Исследовано свето-индуцируемое выделение водорода в процессе разложения воды с помощью двуокиси титана (TiO₂) с наноструктурной морфологией. Выявлена способность монослоев оксидамарганцасамопроизвольно образовывать комплексы с органическими соединениями. Разработан, синтезирован и исследован целый ряд наноразмерных многослойных комплексов на основе оксида марганца. Показано, что данные комплексы могут служить как донорами электрона для ФС-2, так и искусственными катализаторами способными осуществлять реакцию фоторазложения воды с выделением молекулярного кислорода. Эти соединения могут рассматриваться в качестве новой функциональной и структурной модели водо-окисляющего комплекса ФС-2 и могут стать первым шагом к разработке гибридных систем преобразования света [Najafpour et al., 2013; 2014]. Исследовано действие ряда стрессовых факторов (света высокой интенсивности, экстремальных температур) на стабильность природных и искусственных преобразователей солнечной энергии на основе фотосинтетических реакционных центров.

Artificial photosynthesis and Energy production

Among the renewable sources of energy, sun's energy remains underutilized. Hydrogen is one of the most promising future energy sources. As one of the key components of water it is abundant, renewable, produces no environmental pollution in combustion, liberates large amounts of energy per unit weight in combustion, and is easily converted to electricity by fuel cells. Photosystem 2 (PS-2) is unique in that, it is the only enzyme in Nature that can use the energy from the Sun to oxidize water into molecular O₂, hydrogen ions (H⁺) and electrons. The production of hydrogen using artificial photosynthesis requires a source of reducing equivalents as well as protons. Water is the only abundant and renewable source of the electrons and protons. If reaction of photosynthetic water oxidation could be coupled to a hydrogen ion reducing reaction to generate H₂ then a perfect, unlimited and non-polluting fuel cycle could be created.

As a result of realization of aims of the laboratory plans a novel knowledge about mechanism of photosynthetic water oxidation, about ways and intermediates participating in delivery of water molecules into reaction center of PS-2 water-oxidizing complex (WOC) and withdrawal releasing hydrogen ions (protons), about possibilities of substitution of natural WOC by artificial metal-organic complexes and criteria put forth to them, about modes of optimization of WOC functioning, increase of rate of its functioning, efficiency and stability will be obtained. Furthermore, a new data about unsolved questions of the PS-2 acceptor side functioning, about possibilities of substitution of natural electron acceptors, plastoquinone Q_A and pheophytin with artificial electron acceptors possessing programmed properties and compounds, enzymes and/or their complexes, capable to carry out reaction of reduction of protons to hydrogen at the expense of electron and protons releasing in water oxidation reaction will also be obtained.

Concrete task of laboratory is search of ways and receipt experimental information about possibilities for creation of novel high effective nanobiomolecular devices for conversion of sun energy into energy of chemical compounds (photoformation of hydrogen), mimicking natural photosynthesis; getting knowledge required for design, engineering and construction of a semiartificial device which should be able to produce hydrogen. Energy for this process should be provided by the sun and electrons and protons from the water splitting process of oxygenic photosynthesis. Both of these processes are free of costs and the process of water splitting has been optimized by nature since billions of years. The strategy was to use the components best suited for this device which turned out to be a mix of artificial and natural components, i.e. extremely stable photosystems as light sensors and converters and hydrogenases as hydrogen producer. It is proposeв to get information helping to create such semiartificial devices based on (as a first step) core or reaction centre complex of photosystem-2 and natural (as a first step) or totally artificial synthetic hydrogenases.

When this research is complete successfully, it will provide experimental data about new methods of utilization of solar energy with smaller dependence upon rare elements and/or heavy metals. In the future, we can probably even proceed toward development of artificial optimized structures for photochemical CO₂ fixation based on bioorganic resources. In this way, this research will also contribute to solve the global warming problems. Furthermore, with such approach it is possible to decide ecological problems related to increasing oversaturation of Earth atmosphere by “greenhouse” gas and global warming

The laboratory has a long rich successful experience of research in this field of science. We have shown that pheophytin a (Pheo) operates in reaction centers of photosystem 2 (PS-2) as an intermediate electron acceptor between the primary donor, chlorophyll P₆₈₀, and primary electron acceptor, plastoquinone Q_A. The Pheo redox potential of is -536 mV, P₆₈₀ is +1.18 V. For the first time, experimental evidence of recombination origin of "variable" chlorophyll fluorescence of PS-2 was obtained, her lifetime as 4.2 ns and the activation energy of 0.6 -0.8 eV were identified. The ability of PS-2 to the photoreduction of electron acceptors, which are typical for the PS-1 - methyl viologen and NADP⁺ was demonstrated. The possibility of using photoreduction Pheo to quantify the content of PS-2 in whole cells, chloroplasts and subchloroplast preparations was shown [see Allakhverdiev, Klimov, Klevanik, Shuvalov, Krasnovskii, 1977-1986].

It was shown that after complete (more than 95%) removal of endogenous Mn from PS-2 WOC electron transfer through PS-2 [Klimov et al., 1982, Allakhverdiev et al., 1983; 1986a; 1986b; Shafiev et al., 1988; Allakhverdiev & Klimov 1992], as well as function of photosynthetic oxygen evolution [Shafiev et al., 1988; Anan’ev et al., 1988] may be restored by addition of four Mn ions per RC and subsequent photoactivation of the system. It was shown that reactivation of these functions is possible only at the presence of bicarbonate [Allakhverdiev et al., 1997]. Two of the four Mn ions may be substituted by Mg ions or by another two valence metal ions).

It was shown that electron transfer through PS-2 complexes deprived of endogenous Mn as well as in isolated D1/D2/cytochrome b559 PS-2 reaction centers may be restored with synthetic two and three-nuclear Mn-organic complexes based on tripod ligands [Allakhverdiev et al., 1994; Nagata et al., 2008; Kurashov et al., 2009]. The reconstructed PS-2 effective oxidizes water to hydrogen peroxide. This is first report about design artificial photochemical water oxidation by reconstructed PS-2 [Nagata et al., 2008].

It was revealed unique high effective and high specific inhibitors of electron transfer in PS-2, K15-type, derivatives of perfluoroisopropyldinitrobenzol (about 30 compounds), investigated mechanism of their action [Klimov et al., 1992; Klimov et al., 1993; Kiselev et al., 1992; Zharmukhamedov et al., 1992], carried out quantitative structure-activity relationship (QSAR) analysis [Karacan et al., 2012] and shown that mechanism of their action principally differs from that for known inhibitors and is formation of a short circuit of electron transfer from reduced primary electron acceptor, pheophytin, onto oxidized primary electron donor, chlorophyll P680 [Klimov et al., 1995]. It was shown that polypeptide D2, integral component of PS-2 reaction center, is site for binding of new K15-type inhibitors (derivatives of perfluoroisopropyldinitrobenzol), but not known quinone-herbicide-binding site, located in D1-protein [Zharmukhamedov et al., 2003]. Uniqueness of these compounds is ability to catch electron from reduced pheophytin effectively competing with native electron transfer. Thus, these agents may be used for creation of artificial photo-converting systems.

It was shown that polypeptides of PS-2 WOC possess carbonic anhydrase (CA) activity (CAA); that suppression of CAA is accompanied by inhibition of functional activity of PS-2 and as consequence of that by inhibition of photosynthesis in whole [Shitov et al., 2011]. For regulation of carbonic anhydrase activity and consequently functional activity of PS-2 we have designed and synthesized novel chemical compounds derivatives of sulfamide and their complexes with atoms of transitional metals such as copper (Cu), nickel (Ni), chrome (Cr), cobalt (Co) and zinc (Zn) (30 compounds). These agents were investigated by their action on carbonic anhydrase activity of alfa-carbonic anhydrase isozyme II from bovine erythrocytes, betta-class carbonic anhydrase as well as carbonic anhydrase and photosynthetic electron transfer activity of PS-2. From these compounds high effective indictors of CAA of traditional carbonic anhydrases, and what is especially important, CAA and as consequence of that, photosynthetic activity of PS-2 were revealed [Karacan et al., 2014]. These agents may be used for investigation of possibilities for optimization of functional activity of semi artificial photoconverting systems.

Hydrogen (H₂) evolution rates were measured by the gas chromatographic technique upon illumination of different subchloroplast preparations of higher plants without exogenous hydrogenase under anaerobic conditions. Subchloroplast preparations enriched in photosystem II (PS-2) in the presence of an electron donor TMPD (N,N,N,W-tetramethyl-p-phenylenediamine) are shown to have higher H₂-evolution rates (up to 30 nmol/mg Chl per h) than preparations enriched in PS-1 under the same conditions. The data on the suppression of H₂ evolution by well-known inhibitors of PS-2 (dinoseb, atrazine) prove that the H₂ photoproduction is sensitized by PS-2 reaction centers [Mal’tsev et al., 1988].

Furthermore the laboratory have big successful experience on investigation of possible ways for design; engineering and construction of semi artificial and artificial photoconverting systems mimicking photosynthesis. It was investigated light-induced hydrogen production from splitting of water molecules by (TiO₂) with a nanostructure morphology. The ability of manganese oxide monosheets to self-assemble with organic compounds was reveiled. A variety of nanoscale multilayer complexes based on manganese oxide were designed, synthesized and studied. It is shown that these complexes can serve as electron donor for the PS-2 and as artificial catalysts capable to carry out reaction of water photodecomposition with the evolution of molecular oxygen. These compounds can be considered as a new functional and structural model of water-oxidizing complex PS-2 and may be the first step in the development of hybrid systems of the light converting [Najafpour et al., 2013; 2014]. The effect of several stress factors (high intensity light, extreme temperatures) on the stability of natural and artificial solar energy converters based on the photosynthetic reaction centers was studied.

Stress physiology of photosynthesis and

molecular mechanisms of stress resistance of the photosynthetic apparatus

A new type of PSII repair have been discovered and described in the dark (without de novo synthesis of the D1 protein ) after photoinactivation in intact Synechocystis cells at low temperatures (0°-10° C). Salt stress and reactive oxygen species (H₂O₂,¹O₂) inhibit the de novo synthesis of D1 protein under conditions of photoinactivation due to inhibition of transcription and translation of the psbA gene, which encodes the precursor of the D1 protein. 

It was shown that glycine betaine protects not only oxygen evolution in the PSII particles in vitro, but also other reactions associated with electron transport, including the P680 photooxidation and photoreduction of pheophytin under conditions of   thermo- and photoinactivation. Organisms that can synthesize glycine betaine, are characterized by high resistance of PSII to thermal and photoinactivation, as shown in the in vivo model system ofSynechococcus transformed with the codA gene for choline oxidase, which is responsible for the synthesis of glycine betaine.

The important role of the unsaturated fatty acids in resistance of PSII to salt stress have been determined. Cells that can synthesize polyunsaturated FAs are more resistant to NaCl .Mutant cells of Synechocystis, defective in desA and desD genes, for D12-and D6-desaturase, has no polyunsaturated FAs and, consequently, is characterized by hypersensitivity to salt stress. The increase in the content of unsaturated fatty acids in the membranes of Synechococcus, transformed with the gene for the D12-desaturase, greatly enhances the stability of PSII to salt stress.

Carbonic anhydrases and CO₂-concentrating mechanisms

Low concentration of CO₂ in the atmosphere limits the photosynthetic efficiency of plants, and especially aquatic algae, because of the slow rate of diffusion of CO₂ in water.Earlier, it was shown that adaptation of algae to low content of CO₂ is associated with the induction of CO₂-concentrating mechanism (CCM) in photosynthetic microorganisms, different from the previously known C4 or CAM photosynthesis. This mechanism involves the induction of the enzyme carbonic anhydrase (CA) and active transport of inorganic carbon (Ci) into the cell. These studies were complemented by studies on the localization of CA in cells of Chlamydomonas reinhardtii, which showed that one form of CA is localized in the chlorophyll-protein complex of PSII and oriented into the lumen. These data are consistent with the proposed hypothesis on the involvement of thylakoid CA in concentration of molecular form of CO₂ in the stroma by catalytic conversion of bicarbonate into CO₂ in the lumen, followed by its transfer into the stroma along with the concentration gradient. The mutant of C. reinhardtii, CIA-3, deficient in the activity of PSII-CA is unable to grow at a low concentration of CO₂, although it can accumulate Ci cells. We also demonstrate the importance of PSII-CA for the functioning of the CCM in microalgae. Western blotting demonstrated the presence of PSII-CA in Dunaliella salina, spinach, and Arabidopsis. Studies of the kinetic characteristics of this enzyme in D. salina demostrated that  this CA functions at acidic pH of ??lumen. The activity of PSII and of electron transport chain of chloroplast is inhibited by specific inhibitors of the CA. The obtained results suggest the interaction of CCM and O₂-evolving systems of the chloroplast (Sinetova et al. 2012).